Uttesting og validering av metoder for derivatisering og analyse ved hjelp av GC-EI/NCI-MS av tyrosin og nitrotyrosin.

Abstract

3-Nitrotyrosin (3-NT) kan være en mulig biomarkør for å måle nitro-oksidativt stress, og det er derfor av interesse å etablere en metode for å måle konsentrasjonen i humant plasma. 3-NT blir produsert in vivo ved nitrering av tyrosin med reaktive nitrogen forbindelser som peroksynitritt (ONOO-), nitrylklorid (NO2Cl) eller nitrogenoksid radikal (˙NO2). Økt nitrering av tyrosin har blitt observert ved mange inflammatoriske og neurologiske sykdommer. Et annet resultat av nitrering av tyrosin er at den kan forandre de kjemiske og biologiske egenskapene til fritt og proteinbundet tyrosin. Mange ulike analysemetoder, som immunologiske og kromatografiske metoder, har blitt utarbeidet for å måle fritt og proteinbundet nitro-tyrosin i plasma. Men få metoder er blitt etablert for målinger av konsentrasjonen til nitro-tyrosin på grunn av mangel på sensitivitet og spesifisitet. Hensikten med oppgaven var å utvikle en enkel derivatiseringsmetode for å måle fritt nitro-tyrosin og tyrosin i humant plasma. Tyrosin og 3-NT ble først ekstrahert med fastfase kolonnen Strata-X og deretter derivatisert med en kombinasjon av heptafluorbenzyl anhydrid (HFBA) og trimetylsilyl diazometan (TMSD). Metoden viste en god linearitet med R2 = 0,996 for 3-NT og R2 = 0,9989 for tyrosin. Deteksjonsgrensen var 0.2 μg/l for 3-NT og 20 μg/l for tyrosin mens kvantifiseringsgrensen var 0.73 μg/l for 3-NT og 0.17 mg/l for tyrosin. Denne deteksjonsgrensen er noe høyere enn rapportert konsentrasjon av fritt 3-NT og tyrosin i plasma fra friske personer. Rapporterte konsentrasjoner av fritt tyrosin og 3-NT er 12 mg/l og 14 μg/l. Analysemetodene som er utarbeidet er dermed ikke sensitive nok for å kunne måle 3-NT i plasma. Forskjellige ekstraksjons- og derivatiseringsmetoder ble testet, og derivatene av tyrosin og 3-NT ble deretter analysert med gasskromatografi / massespektometri (GC/MS) for å finne den mest sensitive metoden. Ekstraksjonen ble utført med ulike fastfase ekstraksjons (SPE) kolonner og med ultrafiltering. SPE-kolonnene som ble testet var: Omvendt fase-kolonnene Bond Elut C18, Discovery DSC18, Strata-X og ionebytter-kolonnen Strata X-C. Derivatiseringsreagensene som ble testet var: Pentafluorbenzyl bromid (PFBBr), N,O-bis-(trimetylsilyl)trifluorcetamid (BSTFA), N-tert-butyldimetylsilyl-N-metyltrifluoracetamid (MTBSTFA), heptafluorbutansyreanhydrid (HFBA) og TMSD. Oppgaven gir et innblikk i fordeler og ulemper med de forskjellige metodene og prosedyrene som ble testet og validert.